近年來，實時熒光PCR技術在動物疫病診斷中的應用得到了進一步的發展，在診斷動物的病毒性、細菌性和寄生蟲性疫病中得到了廣泛的應用。實時熒光PCR不僅實現了常規PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，實時熒光PCR技術由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度；實時熒光PCR技術全封閉反應，無須PCR后處理，避免污染，了結果的可靠性和重復性。隨著實時熒光PCR試劑盒的進一步開發，實時熒光PCR技術將會在動物疫病診斷中得到更加廣泛的應用。

實時熒光PCR技術是在常規PCR技術的基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。目前報道的熒光探針主要有Taqman，Amplisensor，分子標信，Lightcyclor以及在這4種探針基礎上發展起來的熒光探針。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且與常規的PCR相比，具有靈敏性和特異性高，能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和等特點。目前，已廣泛應用于分子生物學和醫學研究等領域，特別是近幾年來在動物疫病的診斷中得到了廣泛的應用。

1 診斷病毒病

1.1 禽流感

禽流感病毒變異極為頻繁，血清亞型眾多，已報道的有15種血凝素HA亞型（H1～H15）和9種神經氨酸酶NA亞型（N1～N9）。禽流感病毒呈性分布，絕大多數禽流感病毒呈隱性感染，不表現臨床癥狀，只有少數禽流感病毒具有迅速傳播和高致病性的特性。外檢測禽流感病毒的方法是OIE的雞胚病毒分離方法，該方法約需要耗時21 d，不適合禽類進出口的檢疫和發生疫情時的及時診斷。張鶴曉等[1]根據A型流感病毒的核酸保守區共有序列，開發、設計多條引物和探針序列，從中篩選敏感、特異的引物和探針，在循環參數、病毒核酸的提取方法、反轉錄條件的基礎上，建立了快速的通用型“一步法”檢測所有A型流感病毒的通用型熒光RT-PCR。該方法與雞胚病毒分離相比，敏感性基本一致，可直接用來檢測泄殖腔、喉拭子和禽肉，將檢測時間從原來的21 d縮短為4 h。朱文斯等[2]根據禽流感病毒H5亞型的RNA 4節段設計了檢測禽流感病毒H5亞型的引物和探針，其敏感性高能達到10-7，該方法特異性強，與傳染性法氏囊病毒中等毒力及弱毒疫苗、新城疫弱毒疫苗、傳染性支氣管炎弱毒疫苗、鴨瘟弱毒疫苗、鴨病毒性肝炎弱毒疫苗及有可能感染的禽流感病毒H9亞型、新城疫強毒、雞傳染性貧血病毒均不反應。 

1.2 新城疫

新城疫病毒屬于副黏病毒，根據毒株的致病力可分為強毒力型、中等毒力型及弱毒力型。OIE檢測新城疫病毒的方法是雞胚病毒分離方法，需要21 d。張鶴曉等[3]建立的熒光RT-PCR方法不僅能將中強毒力新城疫病毒與弱毒區分開來，而且不與常見的禽類病毒發生交叉反應，其敏感性高可達10-7。楊德勝等[4]利用熒光RT-PCR方法對910份樣品進行新城疫病毒檢測，陽性30份，并用雞胚分離部分檢測樣品，結果一致。說明了熒光RT-PCR方法檢測新城疫病毒具有敏感、特異、快速、、安全等特點。

1.3 口蹄疫

口蹄疫是一種危害偶蹄動物的烈性傳染病，被OIE列為A類動物傳染病。口蹄疫的暴發曾經給許多國家和地區的畜牧業及動物貿易帶來災難性的損失。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，為單股正鏈，血清型復雜多變，有7個血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Aasia1型。傳統的病毒分離鑒定方法耗時長，敏感性和性都較差，ELISA方法敏感性低，常規RT-PCR在樣品進行檢測的過程中容易被污染，以上方法難以適應當前口蹄疫防疫工作的要求。建立一種快速和可靠的診斷方法，對于控制和消滅口蹄疫至關重要。花群義等[5]根據口蹄疫病毒聚合酶3D基因片段非常保守的區域設計的引物、探針，擴增區內口蹄疫病毒 O型、A型、C型、Asia1型、SAT1～3型的序列相同，引物和探針是通用的，建立了熒光RT-PCR方法，對細胞培養物、水皰液、水皰皮及分泌物進行了檢測，得到了滿意的結果，與其他水皰性病毒不發生交叉反應。楊素等[6]應用熒光RT-PCR技術，利用O型口蹄疫病毒的5′端UTR區的IRES片段設計和合成了可檢測7個血清型口蹄疫病毒群特異性引物和Taqman探針，結果表明敏感性高，特異性強，耗時僅為4 h，克服了傳統的病毒分離鑒定方法耗時長，敏感性和性較差，而且容易造成病毒擴散及環境污染的缺點，適用于大批量樣品的快速檢測。

1.4 豬瘟

對豬瘟病毒的傳統診斷方法包括免疫熒光試驗、細胞分離培養、酶聯免疫吸附試驗、動物接種試驗等，這些方法都存在不足之處。溫國元等[7]在豬瘟病毒高度保守的5′端非編碼區作為擴增靶區，設計了兩對引物和一條Taqman探針，建立了熒光RT-PCR方法，該方法的檢測靈敏度可達10拷貝/μL，對不同毒株以及各種組織樣品檢測結果均為陽性，該方法比RT-PCR靈敏度高100倍，與PCR具有相同的靈敏度。陳玉棟等[8]在豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5′端非編碼區設計一對引物和一條熒光探針，結合Light Cycler檢測系統，建立了定量檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的方法，該方法的靈敏度為100拷貝數，整個檢測過程僅需4 h，該方法可望取代傳統的兔體定型反應用于疫苗生產過程中的效價測定及指導疫苗的配制，也為豬瘟病毒分子生物學研究提供了一種新的、簡捷有效的工具。

2 診斷細菌病

2.1 大腸埃希菌O157∶H7

大腸埃希菌O157∶H7是腸出血大腸埃希菌的一種主要血清型，可引起人出血性結腸炎、溶血性尿綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴重并發癥。該菌主要通過食物傳播，動物是其主要的宿主。近年來外各個實驗室診斷大腸埃希菌O157∶H7的檢測方法不斷出現，其中有PCR方法，多重PCR方法，但這些方法檢測時間比較長，檢測過程繁瑣，不適合大規模動物產品的檢測。Jothikumar N等[9]運用一種復合式Sybr Green實時熒光PCR方法快速測定大腸埃希菌O157∶H7，用一對特異引物同時擴增大腸埃希菌O157∶H7的類志賀毒素（stx1或stx2）基因。鑒于擴增后產生的兩個PCR產物的Tm值不等,由此加以區別。此方法操作簡便，快速，特異性好。張險朋等[10]應用實時熒光PCR方法對大腸埃希菌O157∶H7菌株檢測為陽性，而大腸埃希菌O1∶H7，O119，O143及沙門菌無交叉反應，證明應用實時熒光PCR方法檢測大腸埃希菌O157∶H7的特異性強，快速，適用于動物產品快速檢測。

2.2 沙門菌

沙門菌的傳統鑒定方法是挑取單個菌落進行生化方面的試驗，而后利用血清凝集試驗進行分型，由于方法本身的特異性問題而使鑒定的性和靈敏度較差，而且耗費的時間。趙雪濤等[11]根據沙門菌GenBank Accession NO U25352基因序列,設計并合成引物和Taqman探針，將PCR擴增的沙門菌基因片段克隆導入載體,構建的重組質粒經篩選、鑒定后,作為陽性模板,用于標準曲線的制定。利用熒光定量PCR技術進行各類菌株的定性鑒定。應用重組質粒制作的定量曲線,其循環閾值與模板濃度的對數值具有良好的線性關系,相關系數為0.999。檢測各類菌株,其中沙門菌41株、H抗原丟失的沙門菌16株均呈陽性;非沙門菌109株均呈陰性。證明建立的沙門菌的熒光定量PCR方法簡便、快速、。

2.3 炭疽芽孢桿菌

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的人獸共患病，炭疽芽孢在環境中抵抗力*，在軍事上一直被列為*生物戰劑，快速檢驗和鑒定炭疽芽孢桿菌無論對人和草食動物炭疽病診斷，還是應對可能出現的生物恐怖襲擊都十分重要。李偉等[12]采用實時熒光PCR技術，以pXO1質粒上的pag基因、pXO2質粒上的cap基因及染色體上的ropB基因設計引物和探針，應用上述基因探針的外標對照、pagA基因的內標對照等技術建立一種快速、、特異、定性、定量檢測炭疽芽孢桿菌的方法。陳蘇紅等[13]以pXO1質粒上的pag基因及pXO2質粒上的cap基因為靶合成特異引物,用DNA嵌入熒光染料SYBR GreenⅠ進行定量PCR擴增,在PCR后進行熔解曲線分析，以確定得到的產物是否為目的產物。該方法檢測炭疽芽孢桿菌的靈敏度達1 000拷貝。

2.4 胸膜肺炎放線桿菌

豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）有2個生物亞型和15個血清型，傳統的檢測方法有血清學方法和常規PCR方法，均存在不足之處。李樹清等[14]根據APP apxⅣA毒素基因的序列設計了引物和探針，建立實時熒光PCR方法并初步應用，在150份樣品中檢出APP陽性23份。

3 診斷寄生蟲病

王頻佳等[15]利用擴增的弓形蟲529 bp重復序列,經TA克隆后轉化入大腸埃希菌DH5α中;提取重組質粒鑒定后,作為模板建立熒光定量PCR標準曲線,并做重復性試驗和臨床標本檢測，用重組質粒制作的標準曲線循環閾值與模板濃度有良好的線性關系,相關系數為0.995,試驗間變異系數平均為3.28%,無非特異性擴增，樣品檢測陽性率為43.3%。建立了檢測弓形蟲基因的熒光定量方法,具有快速、靈敏、特異的特點。Woo T H等[16]以Light Cycler TM為平臺，利用SYBR GreenⅠ作為熒光染料，建立了一種鑒定鉤端螺旋體的實時 PCR方法,目標片段為16S rRNA,利用熔點曲線分析來區別特異產物、引物二聚體和非特異性產物,不需要電泳來鑒定,該方法快速而敏感,整個過程在20 min內完成。James A H等[17]用以ABIPrism7700SDS為平臺，應用Taqman探針建立了從小牛腹瀉糞便中定量檢測小隱孢子蟲cp11基因和18S rRNA的實時熒光PCR方法。

4 展望

由于實時熒光定量PCR無需內標實時熒光定量，此技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。實時熒光定量PCR解決了雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著[18-19]。由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。美國Texas大學的科研人員經反復實驗，其結論是，內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種的、值得信賴的科學方法[20]。實時熒光PCR技術作為一種新的檢測技術已廣泛應用于動物疫病的診斷。目前，在動物疫病的診斷上，現已發展到至少有15種實時熒光PCR方法。市場上也出現一些動物疫病診斷的實時熒光PCR試劑盒。雖然實時熒光PCR的檢測成本比較高，實時熒光PCR儀比較昂貴，但隨著實時熒光PCR技術的進一步普及和發展，實時熒光PCR試劑盒的進一步開發，以及它具有比傳統病原學、血清學和常規的PCR更敏感、特異、無污染等優點，此技術將會在動物疫病診斷中得到更加廣泛的應用。